APVV HODNOTENIE projektuSK-FR-2015-0014 (2015-2016) pdf
Metabolic Reprogramming as a Target for Cancer and Other Diseases
MARCH 15-16, 2018 MÁLAGA, SPAIN
AB: ide o zaujimavy staro-novy smer boja s onkologickymi a inymi ochoreniami, ktorych charakteristikou je zmeneny metabolizmus napr. Warburgov efekt (1923) u tumotov, ktore vyuzivaju na produkciu ATP malo efektivnu glykolyzu bez toho, aby nou vznikajuce pyruaty boli spracovane mitochondriami na dalsie podstatne mnozstvo ATP. Glykolyza je 15 x menej efektivna na produkciu ATP (2 ATP na glukozu), ale za to 100 x rychlejsie ATP vznika, ako klasickou oxidacnou fosforylaciou pyruatov a NADPH v mitochondriach. Pri tumoroch su akoby mitochondrie vypnute, mozno sa tumor boji ich apoptickej kapacity, alebo aj potrebuje stavebne bloky na rast a delenie neoplastickych buniek. Pricina Warburgovho efektu nie je dosial plne odhalena. Pri glykolyze vznika z glukozy cez produkovane pyruaty a NADPH kys mliecna. Co je este dalsie zaujimave spomenut je, ze glykolyza je podkladom pre anabolicky proces, teda dava stavebne bloky pre rast a delenie tumorovych buniek. Navrat k oxidacnej fosforylacii preferuje katabolicky dej, teda hlavne vznik ATP z glukozy (28-30 ATP / na 1 molekulu glukozy + teplo), cim sa potlaca rast a delenie tumorovych buniek.
Výsledky projektu VEGA 1/0634/13 (2013-2016) _
http://evega.minedu.sk/e-vega/
Počas riešenia projektu vzniklo 10 zahraničných karentovaných publikácií a 1 domáca karentovaná publikácia. Tri ďalšie publikácie z výsledkov VEGA projektu budú nasledovať. Výsledky projektu boli prezentované na 11 zahraničných konferenciách a prednáškach v Aténach [22] a na Univerzite v Strasbourgu (A. Boháč). Počas riešenia projektu sme pripravili viac ako 100 nových počítačom predpovedaných zlúčenín, ktoré boli testované v Nemecku, USA a Francúzsku na ich VEGFR2, TAM TK (rodina: Mer, Axl, Tyro3), CLK1 a SMO aktivitu. Mnohé z testovaných zlúčenín sú nM inhibítory najmä na VEGFR2 a CLK1 kinázy [1, 7, 22 a ďalšie zatiaľ nepublikované].
DFG-IN/OUT + SBCP Počas riešenia projektu sme po detailnej analýze dovtedy všetkých 32 známych PDB VEGFR2 proteínových konformérov a 413 ďalších PDB dostupných kináz objavili dosiaľ neznámu a unikátnu konformáciu tyrozín kinázového proteínu [7, 22 a pripravovaná DFG IN/OUT publikácia], ako ňou podmienenú SBCP (salt bridge containing pocket) doménu [15, 22]. Tento objav umožňuje vývoj nového typu unikátnych kinázových inhibítorov, ktoré majú schopnosť stabilizovať intermediátnu polohu DFG kinázového fragmentu. Nazvali sme ich preto DFG-IN/OUT konformačné inhibítory. Takéto inhibítory sú nové a môžu v sebe skrývať zaujímavý aspekt kinázovej selektivity, ako aj štruktúrnej novosti z hľadiska vývoja liečiv.
YNAMIDY Okrem rozvoja vyššie uvedeného medicínsko chemického poznania špeciálnej DFG-IN/OUT konformácie kináz a identifikácie nového typu inhibítorov (DFG-IN/OUT), ako aj nami vyvinutých nM VEGFR2 a CLK1 kinázových inhibítorov sme rozvíjali aj chemickú problematiku. Chémia ynamidov je v literatúre pomerne vzácna vohľadom na špeciálny (väčšinou nestály) charakter takýchto látok. Ynamidy sme použili na prípravu predpovedaných 1,2,3-triazolových VEGFR2 TK inhibítorov. Odskúšané boli štyri pomerne synteticky náročné cesty, z ktorých len jedna bola úspešná a umožnila prípravu požadovaných VEGFR2 modulátorov. Aj keď tieto zlúčeniny nedosiahli očakávanú kinázovú inhibičnú aktivitu, pomohli nám poukázať a vysvetliť medicínsko-chemický aspekt nevýhodnej izostérnej zámeny oxazolového jadra za 1,2,3-trizolový heterocyklus. Pozorovaný jav sme vysvetlili príliš veľkým rozdielom v polarite 1,2,3-triazolov vzhľadom na pôvodne aktívne oxazolovy, prípadne s tým spojenou silnou dehydratačnou penaltou, ktoré bránia naviazaniu sa triazolových analógov do aktívneho miesta oxazolových inhibítorov v kináze. [5, 24]
CHIMÉRNE VEGFR2 TKI Z moderných syntetických metód sme využili kaplingové reakcie na prípravu chimérnych zlúčenín SYM a ASYM, mimikujúcich dva konforméry ligandu AAZ prítomné v PDB komplexe 1Y6A. V tomto prípade sme 6 a 7 stupňovou syntézou pripravili tri predpovedané zlúčeniny 22SYM, 33SYM a 23ASYM. Aj keď jeden z pripravených inhibítorov 22SYM (IC50 = 15 nM, VEGFR2 TK) bol lepší, ako klinicky používané liečivo Sutent (sunitinib L-malát) 31 nM, jeho aktivita bola stále nižšia, ako sme očakávali. Tento jav vysvetľujeme dynamickým pohybom blízkej aktivačnej A-slučky kinázy, ktorá ľahko môže rozvetvený 22SYM ligand jej nárazmi z väzobného miesta v tyrozín kináze destabilizovať. [7]
Oxazolové deriváty Počas riešenia projektu VEGA sme pripravili viac ako 80 oxazolových derivátov a tak výraznou mierou prispeli k rozvoju chémie oxazolov. Syntéza N,5-diaryloxazol-2-amínov je napriek zaujímavej kinázovej aktivite týchto zlúčenín v chemickej literatúre opísaná málo, príčinou môžu byť ťažko predpovedateľné výťažky (1 - 58 %) tvorby oxazolového jadra klasickou metódou (reakcia izokyanátov resp. izotiokyanátov s azidom za prítomnosti PPh3 v DCM pri rt). Lepšie výťažky dávali niektoré deriváty pri vyššej teplote 90 °C v dioxáne (50-95 %). [6] Zistili sme, že pokiaľ sa reakcia, pri ktorej vzniká z izotiokyanátov a azidov oxazol uskutočňuje tak, že sa r. zmes vloží do predhriateho kúpeľa, významne sa minimalizujú vedľajšie reakcie a získava sa oxazolový produkt v uspokojivých výťažkoch. Uskutočnili sme pomerne veľkú štúdiu elektrónových efektov para a meta substituentov na priebeh vzniku oxazolových zlúčenín, kde sa tiež snažíme zistiť vplyv substituenta na výťažok oxazolového produktu. [zatiaľ nepublikované]
Zistili sme tiež, že oxazol-2-amíny sú zlúčeniny pri ktorých 2-amíno skupina má nezvyčajne silný elektróndonorný vplyv na susbtituenty na fenylovom jadre viazanom polohe C(5) na N,5-diaryloxazol-2-amínoch. Tieto funkčné skupiny (napr. para -COOEt, -CN) sa správajú svojou reaktivitou veľmi neštandardne. Uvedený problém sme zmiernili zmenou vlastností pôvodne silne elektróndonornej amínoskupiny naviazaním deaktivujúcej Boc chániacej skupiny. Zmena elektrónového rozloženia na skelete N,5-diaryloxazol-2-amínov umožnila potom uskutočniť požadované reakcie napr. hydrolýzu –CN skupiny, alebo reakciu –COOEt skupiny s hydroxylamínom. Počas riešenia projektu sme tiež pripravili užitočné a dosiaľ v literatúre neopísané deriváty N,5-diaryloxazol-2-amínov napr. boronát čo je synteticky veľmi žiadaný intermediáte pre ľahkú funkcionalizáciu skeletu takýchto zlúčenín (napr. zavedenie heterocyklických fragmentov). Tiež sa nám podarilo pripraviť oxazoly priamo dekorované na C(5)–COOEt skupinou a z nich pripraviť karbonitrily a amidy. Tento prístup výrazne rozširuje možnosti prípravy ďalších nedostupných derivátov oxazolov. [zatiaľ nepublikované]
Rakovinové kmeňové bunky / Turecko V rámci spolupráce s Francúzskom a Tureckom sme zistili, že TK inhibítory pôsobia síce na diferencované bunky tumoru, ale bunky tumoru s vlastnosťami kmeňových buniek neeradikujú. Toto je v zhode z hypotézou z terapeutickej praxe a publikované v literatúre, že niektoré TK lieky sa po ich aplikácii podieľajú na aktivácii sekundárneho agresívneho onkologického ochorenia. Toto sa vysvetľuje neúčinnosťou týchto látok zničiť rakovinové kmeňové bunky a indukciou ich možnej rezistencie voči danej terapii. Zvyškové rakovinové kmeňové bunky následne obnovia terapiou zmenšený tumor a podieľajú sa aj na metastatickom procese. Novo vytvorené tumorové diferencované bunky sú následne rezistentné voči pôvodnej terapii. Navrhli sme preto v rámci danej publikácie jednoduchý test pre kinázové inhibítory (resp. lieky) a to stanovenie faktoru (aggressiveness factor) charakterizujúceho po liečbe možnú agresivitu a rezistenciu ochorenia na základe stanovenia % počtu rakovinových kmeňových buniek pred a po pôsobení danej látky. Stanovenie tejto charakteristiky kandidátov liečiv, alebo liekov samotných, môže byť užitočné pri povolení liečiva a jeho zvážení pre terapeutickú prax, ako dôležitá charakteristika látok indukovať po ich terapeutickom použití následný nástup agresívnejšieho onkologického ochorenia. [2]
AXL TKI / USA V rámci spolupráce s molekulárnymi biológmi v USA sme pomohli etablovať testovanie selektivity inhibítorov pre TAM rodinu kináz (Mer, Axl, Tyro3) na chimérnom receptore exprimovanom z vloženého génu na tumorových bunkách čínskeho škrečka. Boli vytvorené tri samostatné línie buniek majúce pre každý receptor z TAM rodiny chimérnu EGF extracelulárne citlivú časť a TAM kinázovú časť tak, aby sa zabezpečilo exp. jednoduchá, ako aj ich normalizovaná aktivácia cez EGF rastový faktor. Takýto model umožní relatívne lacný a jednoduchý vývoj selektívnych inhibítorov napr. pre AXL TK ktorá sa považuje za dôležitú pri diseminácii tumorov cez metastázy. [3] Následne sme poslali na testy nami navrhnuté a overené inhibitory Mer TK [17], ako aj predpovedaná AXL TK [23]. Niektoré výsledky sú už dostupné, ale zatiaľ nie sú ešte publikované.
RegBio V rámci vývoja a štúdie oxazol-2-amínových derivátov substituovaných na uhlíku v polohe 5 na oxazole sme si uvedomili, že existuje pravdepodobne možnosť využiť ich regioizomér (substitúcia na C(4) na oxazol-2-amíne) nakoľko jeden z konformérov takéhoto regioizoméru je pravdepodobne schopný zaujať podobné väzobnú polohu ako pôvodný C(5) substituovaný oxazol. Tento jav sme nazvali regioizomérna bioizostéria (RegBio) a momentálne sa snažíme dokázať, že počítačom predpovedané regioizomérne páry, ktoré sú navzájom odlišné zlúčeniny, budú mať podobnú biologickú aktivitu. [16, 18] Dokázanie tejto teórie nielenže prispeje k rozvoju teórie medicínskej chémie, ale umožní podstatné rozšírenie množstva zlúčenín schopných inhibovať nové aj už etablované terapeuticky významné biologické ciele vo všeobecnosti, nielen pre kinázy. Takýmto spôsobom by bolo možné vyvinúť zlúčeniny s novými štruktúrami vhodné pre vývoj liečiv. Na výskume v tejto oblasti naďalej pracujeme.
CLK1 Pomerne významným objavom bola identifikácia aktivity našich N,5-diaryloxazol-2-amínov na dva nepríbuzné, ale biologicky významné kinázové ciele (VEGFR2 a CLK). Testované oxazolové zlúčeniny pôvodne vyvíjané ako VEGFR2 tyrozín kinázové inhibitory mali veľmi dobrú off target aktivitu 20-80 nM aj na nepríbuzný ser-theronín kinázu CLK1 (a v menšej miere aj na iné CMGC ser/thr kinázy). [1] Tieto oxazoly vyzerajú preto byť zaujímavý antitumorový, anti HIV a anti chrípkový farmaceutický cieľ, nakoľko inhibícia CLK kináz je dôležitá z hľadiska utlmenia delenia sa buniek, indukovania apoptózy cez moduláciu pre-mRNA splicingu, čo je pravdepodobne terapeuticky využiteľné v onkológii, Duchennovej svalovej dystrofii, Alzheimerovej chorobe, HIV-1 a chrípkovému vírusu. VEGFR2 inhibícia je tiež zaujímavá z hľadiska utlmenia angiogénneho vplyvu tumoru na okolité cievy a aktiváciu endoteliálnych buniek. [1] Z tohto pohľadu sa dá preto očakávať synergia pôsobenia uvedených oxazolových zlúčenín na onkologické ochorenia, ako aj ich ďalšie širšie terapeutické využitie. V našej práci opisujeme nielen ich prípravu, výsledky biologického testovania, ale aj ich možnú polohu vo väzobnom mieste CLK3 a po optimalizácii proteínového konforméru aj v CLK1. Konformačná analýza CLK1 a CLK3 ukázala, že významným farmakofórom je nielen oxazol-2-amíno fragment, ale aj substitúcia etylsulfónovým fragmentom na jednej z aromatík inhibítorov. Navyše v literatúre je opísaných len veľmi málo účinných VEGFR/CLK duálnych inhibítorov, preto tento objav považujeme za vhodný na ďalšie skúmanie vzhľadom na synergický účinok utlmenia oboch terapeuticky významných typov kináz (VEGFR/CLK). [1]
SMO / FR V rámci druhej spolupráce s Francúzskom (Dr. M. Ruat) vyvíjame modulátory SMO receptoru, čo je kľúčový GPCR GPCR proteín v Hedgehog signálnej dráhe kmeňových buniek. Dôležitou je v tomto prípade nielen jeho inhibícia, ale aj aktivácia. Inhibícia pri rakovinových kmeňových bunkách (liečba tumorov), ako aj SMO aktivácia pri differencovaných somatických bunkách pre regeneratívnu medicínu. Táto spolupráca je na báze testovania differenciácie kmeňových buniek (mesenchymal pluripotent C3H10T1/2 cells) na osteoblasty a stanovenie miery diferenciácie prostredníctvom aktivity alkalickej fosfatázy, ktorá je prítomná len u diferencovaných osteoblastov, teda buniek na ktoré sa použité C3H10T1/2 bunky premenia. Máme už prvé výsledky z výskum v tejto oblasti na diarylmočovinových derivátoch a zlúčeninách s benzoxazinónovým skeletom. Niektoré s nich su agonistami, zatiaľ čo iné sú antagonistami SMO aktivity. [13,14]
Tento VEGA projekt spolu s COST projektami (Angiokem a MuTaLig), francuzskym programom Cotutelle (Mgr. M. Vojtičková a Mgr. P. Šramel spoloční slovensko-francúzsky doktorandi) umožnil rozvíjať medzinárodnú vedeckú spoluprácu najmä s Francúzskom (Dr. G. Hanquet [odkazy na lit. a konf. 1, 2, 5, 6, 15, 17, 19] a Dr. M. Ruat [13]), Španielskom (prof. A.R. Quesada [7, 19]), Tureckom (Dr. R.C. Atalay [2, 5]) a USA (prof. R.B. Birge [3]). Na VEGA projekte pracovalo 5 PhD študentov, 4 Mgr študenti a 1 Bc študent. Počas riešenia projektu 2 PhD študenti úspešne ukončili doktorandské štúdium s témou blízkou zameraniu projeku a v roku 2017 budú končiť ďalší dvaja doktorandi tiež so zameraním dizertačnej práce podobným, ako mal tento projekt. A ďalší výskum, ako aj medzinárodná spolupráca na základe dosiahnutých výsledkov z VEGA projektu pokračuje.
LITERATURA
[1-L]* ADC 2017 Eur J Med Chem 126, 754–761
Novel CLK1 Inhibitors Based on N-aryloxazol-2-amine Skeleton - a Possible Way to Dual VEGFR2 TK / CLK Ligands M. Murár, J. Dobiaš, P. Šramel, G. Addová, G. Hanquet, A. Boháč
[2-L]* ADC 2016 RCS MedChemComm DOI: 10.1039/c6md00392c
Quinoides and VEGFR2 TKIs influence the fate of hepatocellular carcinoma and its cancer stem cells. Deniz Cansen Kahraman, Gilles Hanquet, Loïc Jeanmart, Steve Lanners, Peter Šramel, Andrej Boháč, Rengul Cetin-Atalay;
[3-L]* ADC 2016 Cell Commun & Signaling DOI: 10.1186/s12964-016-0142-1
Normalization of TAM post-receptor signaling reveals a cell invasive signature for Axl tyrosine kinase. S.G. Kimani, S. Kumar, V. Davra, Y.-J. Chang, C. Kasikara, K. Geng, W.-I Tsou, S. Wang, M. Hoque, A. Boháč, A. Lewis-Antes, M.S. De Lorenzo, S.V. Kotenko, R.B. Birge
[4-L] ADD 2016 Gen Physiol Biophys 35 511-514 Inhibition of VEGF mediated post receptor signalling pathways by recently developed tyrosine kinase inhibitor in comparison with sunitinib, R. Moravčík, K. Stebelová, A. Boháč, M. Zeman
[5-L]* ADC 2015 Eur J Med Chem 103 105-122
Ynamide Click chemistry in development of triazole VEGFR2 TK modulators.
Margaréta Vojtičková, Juraj Dobiaš, Gilles Hanquet, Gabriela Addová, Rengul Cetin-Atalay, Deniz Cansen Yildirim, Andrej Boháč
[6-L] ADC 2015 J Het Chem 52 425-39
Selected Methodologies Convenient for the Synthesis of N,5-Diaryloxazole-2-amine Pharmacophore Lucia Lintnerová, Lucia Kováčiková, Gilles Hanquet, Andrej Boháč
[7-L]* ADC 2014 Eur J Med Chem 72, 146-159
A development of chimeric VEGFR2 TK inhibitor based on two ligand conformers from PDB: 1Y6A complex – Medicinal chemistry consequences of a TKs analysis
Lucia Lintnerová, Melissa García-Caballero, Fridrich Gregáň, Milan Melicherčík, Ana R. Quesada, Juraj Dobiaš, Ján Lác, Marta Sališsová, Andrej Boháč
[8-L] ADC 2015 Comput and Theor Chem 1062 50–55
Molecular structure and acidity of captopril, zofenopril and their metabolites captopril disulfide and zofenoprilat Milan Remko, Joanna Bojarska, Anna Remkova, Waldemar Maniukiewicz
[9-L] ADC Journal of Molecular Structure 1059 (2014) 124–131Structure, acidity and basicity of a benzene disulfonamide inhibitor of carbonic anhydrase Milan Remko, Peter Herich, Fridrich Gregáň, Jozef Kožíšek
[10-L] ADC 2014 Chemical Physics Letters 614 214–219
Acidity and metal (Mg2+, Ca2+, Zn2+) affinity of l-gamma-carboxyglutamicacid and its peptide analog Milan Remko, Ria Broer, Anna Remková, Piet Th. Van Duijnen
[11-L] ADC Chemical Physics Letters 621 (2015) 12–17 How strong are Ca2+–heparin and Zn2+–heparin interactions? Milan Remko, Ria Broer, Anna Remková, Piet Th. Van Duijnen
[13-K] AFE NCSR Democritos / University of Patras GREECE Chemical Approaches to Taggeting Drug Resistance in Cancer Stem Cells 26-27 March 2015, Athens, Greece A classification of known scaffolds of Smoothened inhibitors for identification of novel Smo modulators J. Dobiaš, M. Murár, P. Šramel, G. Hanquet, M. RUat, H. Faure, A. Bohac
[14-K] AFA Universitat de Barcelona 19-20 January 2015, Targeting Hedgehog Signaling in Cancer Stem Cells Review and VHTS identification of Smo modulators J. Dobiaš, A. Boháč
[15-K] AFE Eötvös Loránd University Budapest 19-20 november 2016 Design and Synthesis of TKIs Specially Interacting with SBCP (VEGFR2 TK) P. Šramel, M. Murár, G. Hanquet, A. Boháč
[16-K] AFA University Siena Italy, Tenth European Workshop in Drug Design Certosi di Pontignano, Siena Italy 17-22 May 2015 Development of AAZ-Regioisomeric VEGFR2 TK inhibitors P. Šramel, A. Boháč
[17-K] AFA Universidad de La Laguna, Chemical Approaches to Targeting Drug Resistance in Cancer Stem Cells 14-15 October 2014, Puerto de la Cruz An efficient identification of Mer TK validated hits – exploitation of this methodology to Axl TK and Smo (a key mediator of the Hedgehog pathway) Juraj Dobiaš, Gilles Hanquet, Andrej Boháč
[18-K] AFA 4th Meeting of the Paul Ehrlich MedChem Euro-PhD Network 20th – 22nd June 2014, Hradec Králové, Czech Republic 1/ DEVELOPMENT OF OXAZOLCARBOXAMIDE VEGFR-2 INHIBITORS 2/ DEVELOPMENT AND SYNTHESIS OF AAZ-REGIOISOMERIC VEGFR2 TK MODULATORS v zborniku nam neuviedli podakovanie VEGA1/0634/13 1/ J. Dobiaš, P- Ribar, A. Boháč 2/ P. Šramel, A. Boháč
[19-K] AFA Eötvös Loránd University Budapest 27-28 marec 2014 Chemical Approaches to Targeting Drug Resistance in CSCs A discovery of unusual inactive TKs with an opened A-loop and its MCH consequences. Development of TK (VEGFR2, Mer, Axl, Tyro 3) inhibitors J. Dobiaš, P. Šramel, A.R.Quesada, G. Hanquet, A. Boháč
